系统性红斑狼疮(SLE)基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM分析法)

作|者|：疾控科研试剂博客

联|系：I99I-4747-I94

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种自身免疫性疾病，患者体内有多种自身抗体沉淀形成免疫复合物，可造成慢性炎症和多器官功能损伤，此病多见于育龄期女性[1-2]。一项全球性研究显示SLE患病率为每年9~241/10万，目前SLE的发病机制仍不清楚，研究报道SLE发病与遗传和环境因素共同作用有关[3]。环状RNA (circular RNA，circRNA)是一种具有闭合环状结构的内源性非编码RNA，在基因的表达调控方面发挥着重要作用[4]。与线性RNA相比，circRNA不仅具有更丰富的表达量，而且具有更高的稳定性[5-6]。circRNA在多种肿瘤、神经系统疾病、自身免疫性疾病中表达失调，广泛的参与各类疾病的发生、发展[7-9]。目前，已有研究表明circRNA参与SLE炎性调节过程中的基因表达[10-12]。分析circRNA与SLE早期诊断和预后的关系及其在SLE发病过程中的作用，具有重要的价值和意义[13-14]。

为探寻SLE相关circRNA分子靶标并评估其在SLE发生发展生物标志物的可能性，我们前期通过分析外周血单核细胞PBMCs(peripheral blood mononuclear cells)样本RNA-seq测序数据[15]，挑选出了3个显著性差异基因[P 0.01, fold change(差异值)2] circADCY9，circGARS，circMCTP2为研究目标。本研究拟设计引物通过RT-qPCR验证其表达情况，对circRNA的稳定性及耐受程度进行检测，通过结合SLE临床指标关联分析评估其潜在的诊断价值及意义。

1 材料与方法1.1 研究对象

SLE组病例来自2018年3月至2019年10月在重庆西南医院就诊的患者，其中男3例，女32例；年龄7~56(37.4±12.9)岁。临床诊断符合1997年美国风湿协会修订的诊断标准[16]，除外感染、肿瘤及其他结缔组织病。健康对照者(HC组)来自重庆西南医院健康体检者，其中男2例，女23例；年龄23~56(39.8±9.4)岁。两组性别年龄无显著差异。收集SLE患者临床相关指标并进行SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)评分[17]。SLEDAI评分0~18(8.5±4.9)分，其中基本无活动：10例(28.6%)，轻度活动：11例(31.4%)，中度活动9例(25.7%)，重度活动5例(14.3%)。研究经中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准，获得每位参与者书面知情同意。患者的临床资料见表 1。

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表 1 本研究中SLE患者的临床资料(n=35)

临床资料

例数(%)

皮肤表现

11(31.4)

脱发

10(28.6)

关节炎

10(28.6)

蛋白尿

16(45.7)

血尿

4(11.4)

胸膜炎

8(22.8)

血小板减少

6(17.1)

白细胞减少

7(20.0)

低补体

26(74.2)

Anti-dsDNA

8(22.8)

Anti-sm

11(31.4)

Anti-SSA

15(42.8)

Anti-SSB

3(8.5)

Anti-RO52

15(42.8)

Anti-ANA

33(94.2)

Anti-RNP

10(28.6)

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1.2 主要试剂和仪器

人单个核细胞分离液Ficoll购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；总RNA提取试剂Trizol购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScript RT逆转录试剂盒购自成都微克生物技术有限公司；qPCR SYBR Green购自武汉生命之美科技有限公司；基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000紫外分光光度计为美国Nanodrop公司产品；伯乐CFX Connect PCR仪器为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 PBMCs及总RNA提取

采集受试者清晨空腹静脉血3~5 mL至EDTA抗凝管，2 h内送入实验室，Ficoll分离液分离PBMCs，Trizol试剂盒提取总RNA，通过分光光度计测量提取的RNA质量，-80 ℃保存。

1.4 RT-qPCR检测

引物设计按照常规PCR引物设计原理，利用primer premier 5.0软件跨剪接位点上下游进行设计，将设计好的引物序列导入NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中，采用Primer-Blast工具进行引物特异性比对分析，利用PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，采用20 μL反应体系进行检测。反应体系包括：1 μL反转录产物、0. 5 μmol/L上游引物、0. 5 μmol/L下游引物、1×SYBR荧光染料试剂。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s变性，60 ℃ 34 s退火延伸，读板，扩增循环40次。所有样品做3个复孔。RT-qPCR使用伯乐CFX Connect荧光定量PCR仪进行。分析待测标本的扩增熔解曲线，均为单峰，无非特异性扩增。结果以CT值显示，采用相对定量法对RT-qPCR结果进行分析，计算2-ΔCt。引物序列见表 2。

表 2 荧光定量PCR引物序列

名称

引物序列(5′-3′)

ADCY9

正义:CTCCTGCTCTTGTTGGTCTGGTTC

反义:CTCTGGATCTTGGTGCGGTGAAG

GARS

正义:GGCAGCACATGGAGAATGAGATGG

反义:ACAGGAACGATCAGCACATCCAAC

MCTP2

正义:GCCACAGCGATCTCGGACAAC

反义:GATGCACCAGAAGAGCCAGAGAAG

circADCY9

正义:TGAGACCAACATACACGTCAT

反义:GGAGCTGAAGGTGGGACTAG

circGARS

正义:TGCCATTTGTGATGAGTGCT

反义:CAACAATCTCAATCCAACCCCT

circMCTP2

正义:TGGAGAAAGGATTAAGAAGTATT

反义:GTCCTGGATGCTGCTGAC

β-actin

正义:5′-GGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3′

反义:5′-CTCCGACCAGTGTTTGCCTT-3′

表选项

1.5 统计学处理

统计分析和图形采用GraphPad Prism 8.0软件进行，两组样本进行t检验，两个变量之间相关性采用Pearson相关分析。受试者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线分析评价circRNA诊断和鉴别诊断的敏感性和特异性。

2 结果2.1 RT-qPCR检测实验组和健康对照组circADCY9，circGARS，circMCTP2表达情况

结果显示circADCY9，circGARS在35例SLE患者相较25例健康人PBMCs中表达上调，circMCTP2表达下调(P均 0.000 1，图 1)。差异有统计学意义。

图 1 circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)在实验组和对照组中的表达情况比较

图选项

2.2 PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达水平与SLE患者临床参数之间相关性分析

SLE患者circADCY9、circGARS表达水平与SLEDAI评分呈正相关(两者P值均 0.000 1，r分别为0.841 7和0.801 0)，circMCTP2表达水平与SLEDAI评分呈负相关(P 0.000 1，r=-0.810 2)。SLE患者circADCY9、circGARS表达水平与补体C3呈负相关(两者P值分别为 0.001 5和 0.000 5，两者r值分别为-0.509 4和-0.551 1)，circMCTP2表达水平与补体C3呈正相关(P 0.012 1，r=0.414 0，图 2、3)。而与其他临床指标(dsDNA，Anti-sm、C4、抗核抗体等)不相关。

图 2 SLE患者circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)表达水平与SLEDAI评分相关分析结果

图选项

图 3 SLE患者PBMCs中circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)表达水平与补体C3水平相关分析结果

图选项

2.3 PBMCs中3种circRNA对SLE患者诊断的价值

对SLE患者和健康对照者的PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达水平进行ROC曲线分析。CircADCY9的ROC曲线下AUC为0.850 0(95%CI：0.749 4-0.950 6；P 0.0001)。CircGARS的ROC曲线下AUC为0.826 7(95%CI：0.725 0-0.928 3；P 0.000 1)。CircMCTP2的ROC曲线下AUC为0.895 6(95%CI：0.817 8-0.973 3;P 0.000 1)。见图 4。

图 4 实验组和对照组PBMCs中circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)的ROC曲线分析

图选项

2.4 RNaseR处理前后circADCY9，circGARS，circMCTP2表达差异情况比较

选取6例SLE患者和3例健康对照者PBMCs总RNA使用RNaseR处理前后circADCY9，circGARS，circMCTP2表达差异情况比较。结果显示circADCY9，circGARS在RNaseR处理前后表达上调且总体趋势一致，circMCTP2表达下调且总体趋势一致(图 5)。PCR产物电泳检测显示β-actin、circADCY9、circGARS、circMCTP2条带清晰可见(图 6)。RNaseR处理前后circADCY9及mRNA电泳检测结果提示，circADCY9在使用RNaseR处理前后表达影响不大，而β-actin及线性ADCY9条带明显变浅(图 7)。

a: P 0.01, 与HC组比较图 5 RNaseR处理前后实验组和对照组PBMCs中circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)的表达情况

图选项

图 6 PCR检测PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达

图选项

图 7 PCR检测PBMCs中使用RnaseR处理前后circADCY9、线性ADCY9表达

图选项

3 讨论

SLE是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其特征是自身抗体产生，补体激活和免疫复合物沉积[18]。临床上比较常用的诊断标记物如抗核抗体(ANAs)，抗双链DNA(dsDNA)抗体以及抗史密斯(Anti-Sm)抗体等对于SLE的早期筛查和诊断具有重要的意义，但是这些传统的实验室指标缺乏高特异性或者是高敏感性[19]。circRNA作为一种大量存在于哺乳动物的内源性的非编码RNA，表达丰富且具有较高的稳定性[20]。它最主要的功能是参与转录后调控，类似于一个内源性RNA或miRNA的海绵，可以竞争性的抑制RNA/miRNA的转录调控[21-22]。circRNA还可以通过抑制转录起始位点调节可变剪切或转录，调节其亲本基因的表达[23]。此外，部分circRNA分子吸附蛋白质因子与RNA结合蛋白相互作用，circRNA还可被翻译成蛋白质[24-25]。

circRNA与SLE密切相关，研究发现：hsa_circ_0045272可以充当miR-6127的海绵并对T细胞的凋亡和IL-2分泌进行调节[14]；Hsa_circ_0012919在SLE患者中的下调增加甲基转移酶1的表达并降低了CD70、CD11a的表达，逆转了SLE CD4+ T细胞中CD70和CD11a的DNA甲基化不足[26]；SLE患者PBMCs中存在蛋白激酶磷酸化的增强和circRNA降低，circRNA可形成不完全的RNA双链，并充当与天然免疫相关的双链RNA激活蛋白激酶的抑制剂[27]；hsa_circ_0049224和has_circ_0049220可用于评估低甲基化的生物标志并参与SLE的活动[28]；circIBTK在SLE中下调，并与SLEDAI评分、抗dsDNA和补体C3水平相关，circIBTK可能通过与SLE中的MIR-29b结合来调节DNA去甲基化和AKT信号通路[29]；hsa_circ_0021372和hsa_circ_0075699水平与补体C3和C4表达水平有关，hsa_circ_0057762水平与SLEDAI-2K评分呈正相关[30]。以上研究提示，circRNA在SLE发生发展中发挥重要的作用，研究circRNA与SLE发病的关系，对探索SLE的生物诊断标记物及其发病机制，具有重要的意义。

本研究中circADCY9、circGARS在SLE患者中表达增高，且其表达水平与SLE患者SLEDAI评分呈正相关，与补体C3水平呈负相关，说明circADCY9、circGARS的表达水平与SLE的严重程度呈正比，患者疾病越严重，circADCY9、circGARS的表达水平越高。circMCTP2在SLE患者中低表达，其表达水平与SLE患者SLEDAI评分呈负相关，与补体C3呈正相关，说明circMCTP2的表达水平与SLE的严重程度呈反比，患者疾病越严重，circMCTP2的表达水平越低。系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)具有较好的有效性和对变化的敏感性，能对SLE患者的病情严重程度进行评估[31]。补体C3的降低表明自身抗体增加，免疫激活，与SLE疾病的活动性呈负相关，在SLE的诊断中具有筛查价值[32-33]。通过评估circRNA与SLEDAI和C3的关系能够一定程度上反应circRNA与SLE严重程度和活动性关系。ROC曲线分析提示：三者曲线下面积(AUC)在0.8~0.9之间，诊断效能较好。进一步对RNaseR处理前后3种circRNA表达情况进行比较以及PCR产物跑胶验证结果提示：circRNA表达情况较为稳定，circRNA相较于mRNA对RNaseR的耐受性更好。既往的研究也证实：与线性RNA相比，circRNA分子呈封闭环状的结构，能在很大程度上能抵抗核酸外切酶的活性[34]。综上，SLE患者PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达明显异常，这3种circRNA表达稳定，其表达水平与SLE的严重程度具有相关性。

本研究尚存在一些不足及影响因素: ①不同SLE患者异质性较大；②本文收集的SLE病例并非均是初诊未治疗的，药物可能对其表达有影响；③SLE发病机制较复杂受限因素较多；④SLE患者的研究样本量较少；⑤没有检测治疗前后以及初诊和复诊患者之间circRNA的表达差异，无法明确其在预后监测中的疗效。在后续的研究中将进一步扩大样本量检测SLE患者PBMCs中circRNA的表达，使研究结果更具有可靠性。