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系统性红斑狼疮(SLE)基因甲基化检测试剂盒(MS-HRM分析法)
作|者|:疾控科研试剂博客
联|系:I99I-4747-I94
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种自身免疫性疾病,患者体内有多种自身抗体沉淀形成免疫复合物,可造成慢性炎症和多器官功能损伤,此病多见于育龄期女性[1-2]。一项全球性研究显示SLE患病率为每年9~241/10万,目前SLE的发病机制仍不清楚,研究报道SLE发病与遗传和环境因素共同作用有关[3]。环状RNA (circular RNA,circRNA)是一种具有闭合环状结构的内源性非编码RNA,在基因的表达调控方面发挥着重要作用[4]。与线性RNA相比,circRNA不仅具有更丰富的表达量,而且具有更高的稳定性[5-6]。circRNA在多种肿瘤、神经系统疾病、自身免疫性疾病中表达失调,广泛的参与各类疾病的发生、发展[7-9]。目前,已有研究表明circRNA参与SLE炎性调节过程中的基因表达[10-12]。分析circRNA与SLE早期诊断和预后的关系及其在SLE发病过程中的作用,具有重要的价值和意义[13-14]。
为探寻SLE相关circRNA分子靶标并评估其在SLE发生发展生物标志物的可能性,我们前期通过分析外周血单核细胞PBMCs(peripheral blood mononuclear cells)样本RNA-seq测序数据[15],挑选出了3个显著性差异基因[P 0.01, fold change(差异值)2] circADCY9,circGARS,circMCTP2为研究目标。本研究拟设计引物通过RT-qPCR验证其表达情况,对circRNA的稳定性及耐受程度进行检测,通过结合SLE临床指标关联分析评估其潜在的诊断价值及意义。
1 材料与方法1.1 研究对象
SLE组病例来自2018年3月至2019年10月在重庆西南医院就诊的患者,其中男3例,女32例;年龄7~56(37.4±12.9)岁。临床诊断符合1997年美国风湿协会修订的诊断标准[16],除外感染、肿瘤及其他结缔组织病。健康对照者(HC组)来自重庆西南医院健康体检者,其中男2例,女23例;年龄23~56(39.8±9.4)岁。两组性别年龄无显著差异。收集SLE患者临床相关指标并进行SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)评分[17]。SLEDAI评分0~18(8.5±4.9)分,其中基本无活动:10例(28.6%),轻度活动:11例(31.4%),中度活动9例(25.7%),重度活动5例(14.3%)。研究经中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院伦理委员会批准,获得每位参与者书面知情同意。患者的临床资料见表 1。
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表 1 本研究中SLE患者的临床资料(n=35)
临床资料
例数(%)
皮肤表现
11(31.4)
脱发
10(28.6)
关节炎
10(28.6)
蛋白尿
16(45.7)
血尿
4(11.4)
胸膜炎
8(22.8)
血小板减少
6(17.1)
白细胞减少
7(20.0)
低补体
26(74.2)
Anti-dsDNA
8(22.8)
Anti-sm
11(31.4)
Anti-SSA
15(42.8)
Anti-SSB
3(8.5)
Anti-RO52
15(42.8)
Anti-ANA
33(94.2)
Anti-RNP
10(28.6)
表选项
1.2 主要试剂和仪器
人单个核细胞分离液Ficoll购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;总RNA提取试剂Trizol购自天根生化科技(北京)有限公司;PrimeScript RT逆转录试剂盒购自成都微克生物技术有限公司;qPCR SYBR Green购自武汉生命之美科技有限公司;基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Nanodrop ND-1000紫外分光光度计为美国Nanodrop公司产品;伯乐CFX Connect PCR仪器为美国Bio-Rad公司产品。
1.3 PBMCs及总RNA提取
采集受试者清晨空腹静脉血3~5 mL至EDTA抗凝管,2 h内送入实验室,Ficoll分离液分离PBMCs,Trizol试剂盒提取总RNA,通过分光光度计测量提取的RNA质量,-80 ℃保存。
1.4 RT-qPCR检测
引物设计按照常规PCR引物设计原理,利用primer premier 5.0软件跨剪接位点上下游进行设计,将设计好的引物序列导入NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中,采用Primer-Blast工具进行引物特异性比对分析,利用PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,采用20 μL反应体系进行检测。反应体系包括:1 μL反转录产物、0. 5 μmol/L上游引物、0. 5 μmol/L下游引物、1×SYBR荧光染料试剂。PCR反应条件为:95 ℃ 5 min预变性;95 ℃ 10 s变性,60 ℃ 34 s退火延伸,读板,扩增循环40次。所有样品做3个复孔。RT-qPCR使用伯乐CFX Connect荧光定量PCR仪进行。分析待测标本的扩增熔解曲线,均为单峰,无非特异性扩增。结果以CT值显示,采用相对定量法对RT-qPCR结果进行分析,计算2-ΔCt。引物序列见表 2。
表 2 荧光定量PCR引物序列
名称
引物序列(5′-3′)
ADCY9
正义:CTCCTGCTCTTGTTGGTCTGGTTC
反义:CTCTGGATCTTGGTGCGGTGAAG
GARS
正义:GGCAGCACATGGAGAATGAGATGG
反义:ACAGGAACGATCAGCACATCCAAC
MCTP2
正义:GCCACAGCGATCTCGGACAAC
反义:GATGCACCAGAAGAGCCAGAGAAG
circADCY9
正义:TGAGACCAACATACACGTCAT
反义:GGAGCTGAAGGTGGGACTAG
circGARS
正义:TGCCATTTGTGATGAGTGCT
反义:CAACAATCTCAATCCAACCCCT
circMCTP2
正义:TGGAGAAAGGATTAAGAAGTATT
反义:GTCCTGGATGCTGCTGAC
β-actin
正义:5′-GGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3′
反义:5′-CTCCGACCAGTGTTTGCCTT-3′
表选项
1.5 统计学处理
统计分析和图形采用GraphPad Prism 8.0软件进行,两组样本进行t检验,两个变量之间相关性采用Pearson相关分析。受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析评价circRNA诊断和鉴别诊断的敏感性和特异性。
2 结果2.1 RT-qPCR检测实验组和健康对照组circADCY9,circGARS,circMCTP2表达情况
结果显示circADCY9,circGARS在35例SLE患者相较25例健康人PBMCs中表达上调,circMCTP2表达下调(P均 0.000 1,图 1)。差异有统计学意义。
图 1 circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)在实验组和对照组中的表达情况比较
图选项
2.2 PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达水平与SLE患者临床参数之间相关性分析
SLE患者circADCY9、circGARS表达水平与SLEDAI评分呈正相关(两者P值均 0.000 1,r分别为0.841 7和0.801 0),circMCTP2表达水平与SLEDAI评分呈负相关(P 0.000 1,r=-0.810 2)。SLE患者circADCY9、circGARS表达水平与补体C3呈负相关(两者P值分别为 0.001 5和 0.000 5,两者r值分别为-0.509 4和-0.551 1),circMCTP2表达水平与补体C3呈正相关(P 0.012 1,r=0.414 0,图 2、3)。而与其他临床指标(dsDNA,Anti-sm、C4、抗核抗体等)不相关。
图 2 SLE患者circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)表达水平与SLEDAI评分相关分析结果
图选项
图 3 SLE患者PBMCs中circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)表达水平与补体C3水平相关分析结果
图选项
2.3 PBMCs中3种circRNA对SLE患者诊断的价值
对SLE患者和健康对照者的PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达水平进行ROC曲线分析。CircADCY9的ROC曲线下AUC为0.850 0(95%CI:0.749 4-0.950 6;P 0.0001)。CircGARS的ROC曲线下AUC为0.826 7(95%CI:0.725 0-0.928 3;P 0.000 1)。CircMCTP2的ROC曲线下AUC为0.895 6(95%CI:0.817 8-0.973 3;P 0.000 1)。见图 4。
图 4 实验组和对照组PBMCs中circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)的ROC曲线分析
图选项
2.4 RNaseR处理前后circADCY9,circGARS,circMCTP2表达差异情况比较
选取6例SLE患者和3例健康对照者PBMCs总RNA使用RNaseR处理前后circADCY9,circGARS,circMCTP2表达差异情况比较。结果显示circADCY9,circGARS在RNaseR处理前后表达上调且总体趋势一致,circMCTP2表达下调且总体趋势一致(图 5)。PCR产物电泳检测显示β-actin、circADCY9、circGARS、circMCTP2条带清晰可见(图 6)。RNaseR处理前后circADCY9及mRNA电泳检测结果提示,circADCY9在使用RNaseR处理前后表达影响不大,而β-actin及线性ADCY9条带明显变浅(图 7)。
a: P 0.01, 与HC组比较图 5 RNaseR处理前后实验组和对照组PBMCs中circADCY9(A)、circGARS(B)、circMCTP2(C)的表达情况
图选项
图 6 PCR检测PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达
图选项
图 7 PCR检测PBMCs中使用RnaseR处理前后circADCY9、线性ADCY9表达
图选项
3 讨论
SLE是一种慢性全身性自身免疫性疾病,其特征是自身抗体产生,补体激活和免疫复合物沉积[18]。临床上比较常用的诊断标记物如抗核抗体(ANAs),抗双链DNA(dsDNA)抗体以及抗史密斯(Anti-Sm)抗体等对于SLE的早期筛查和诊断具有重要的意义,但是这些传统的实验室指标缺乏高特异性或者是高敏感性[19]。circRNA作为一种大量存在于哺乳动物的内源性的非编码RNA,表达丰富且具有较高的稳定性[20]。它最主要的功能是参与转录后调控,类似于一个内源性RNA或miRNA的海绵,可以竞争性的抑制RNA/miRNA的转录调控[21-22]。circRNA还可以通过抑制转录起始位点调节可变剪切或转录,调节其亲本基因的表达[23]。此外,部分circRNA分子吸附蛋白质因子与RNA结合蛋白相互作用,circRNA还可被翻译成蛋白质[24-25]。
circRNA与SLE密切相关,研究发现:hsa_circ_0045272可以充当miR-6127的海绵并对T细胞的凋亡和IL-2分泌进行调节[14];Hsa_circ_0012919在SLE患者中的下调增加甲基转移酶1的表达并降低了CD70、CD11a的表达,逆转了SLE CD4+ T细胞中CD70和CD11a的DNA甲基化不足[26];SLE患者PBMCs中存在蛋白激酶磷酸化的增强和circRNA降低,circRNA可形成不完全的RNA双链,并充当与天然免疫相关的双链RNA激活蛋白激酶的抑制剂[27];hsa_circ_0049224和has_circ_0049220可用于评估低甲基化的生物标志并参与SLE的活动[28];circIBTK在SLE中下调,并与SLEDAI评分、抗dsDNA和补体C3水平相关,circIBTK可能通过与SLE中的MIR-29b结合来调节DNA去甲基化和AKT信号通路[29];hsa_circ_0021372和hsa_circ_0075699水平与补体C3和C4表达水平有关,hsa_circ_0057762水平与SLEDAI-2K评分呈正相关[30]。以上研究提示,circRNA在SLE发生发展中发挥重要的作用,研究circRNA与SLE发病的关系,对探索SLE的生物诊断标记物及其发病机制,具有重要的意义。
本研究中circADCY9、circGARS在SLE患者中表达增高,且其表达水平与SLE患者SLEDAI评分呈正相关,与补体C3水平呈负相关,说明circADCY9、circGARS的表达水平与SLE的严重程度呈正比,患者疾病越严重,circADCY9、circGARS的表达水平越高。circMCTP2在SLE患者中低表达,其表达水平与SLE患者SLEDAI评分呈负相关,与补体C3呈正相关,说明circMCTP2的表达水平与SLE的严重程度呈反比,患者疾病越严重,circMCTP2的表达水平越低。系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)具有较好的有效性和对变化的敏感性,能对SLE患者的病情严重程度进行评估[31]。补体C3的降低表明自身抗体增加,免疫激活,与SLE疾病的活动性呈负相关,在SLE的诊断中具有筛查价值[32-33]。通过评估circRNA与SLEDAI和C3的关系能够一定程度上反应circRNA与SLE严重程度和活动性关系。ROC曲线分析提示:三者曲线下面积(AUC)在0.8~0.9之间,诊断效能较好。进一步对RNaseR处理前后3种circRNA表达情况进行比较以及PCR产物跑胶验证结果提示:circRNA表达情况较为稳定,circRNA相较于mRNA对RNaseR的耐受性更好。既往的研究也证实:与线性RNA相比,circRNA分子呈封闭环状的结构,能在很大程度上能抵抗核酸外切酶的活性[34]。综上,SLE患者PBMCs中circADCY9、circGARS、circMCTP2表达明显异常,这3种circRNA表达稳定,其表达水平与SLE的严重程度具有相关性。
本研究尚存在一些不足及影响因素: ①不同SLE患者异质性较大;②本文收集的SLE病例并非均是初诊未治疗的,药物可能对其表达有影响;③SLE发病机制较复杂受限因素较多;④SLE患者的研究样本量较少;⑤没有检测治疗前后以及初诊和复诊患者之间circRNA的表达差异,无法明确其在预后监测中的疗效。在后续的研究中将进一步扩大样本量检测SLE患者PBMCs中circRNA的表达,使研究结果更具有可靠性。